技術(shù)文章/ARTICLES

    骨髓作為主要的造血場(chǎng)所，可進(jìn)行體外培養(yǎng)。在無(wú)菌條件下，把骨髓細(xì)胞分離出來(lái)，置于培養(yǎng)系統(tǒng)中，在合適的環(huán)境中，提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使其繼續(xù)生存或生長(zhǎng)。通過(guò)培養(yǎng)骨髓，可見(jiàn)到造血干細(xì)胞不同分化階段時(shí)各種血細(xì)胞的前驅(qū)細(xì)胞。用通常的形態(tài)學(xué)方法不可能識(shí)別造血干細(xì)胞和各種血細(xì)胞的前驅(qū)細(xì)胞，但在加入各種造血因子的半固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)后，可出現(xiàn)單個(gè)前驅(qū)血細(xì)胞的增殖、分化，并形成細(xì)胞克隆。

一、材料

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠(C57BL／6\B6D2Fl等)2只。

2．培養(yǎng)液瓊脂(Difco)、a—MEM、FBS(用新生牛血清、人血清也可)。

3．器具吸管、試管、注射器、25ml培養(yǎng)瓶、35mm塑料培養(yǎng)皿、血細(xì)胞計(jì)數(shù)器、解利用具、倒置顯微鏡、解剖顯微鏡。

4．試劑Turk液(白細(xì)胞稀釋液)。

二、方法

1．軟瓊脂培養(yǎng)液的制備將瓊脂30mg置于一試管中，加蒸餾水3ml，103．4kPa高壓滅菌，待冷卻至50℃～60℃時(shí)加2倍濃度的a-MEM等量混合，置于42℃水浴中保溫。

2．取材小鼠經(jīng)麻醉處死，全身浸泡于75％乙醇中消毒5min，拎出后將小鼠仰面翻鋪于超凈臺(tái)上一個(gè)消毒托盤(pán)上。用眼科鑷小心捏起小鼠兩髖關(guān)節(jié)之間的腹部皮膚，用眼科剪小心剪開(kāi)皮膚，并分離兩下肢的皮膚，往下在腳踝處剪斷，往上在髖關(guān)節(jié)處剪斷，這樣可以游離出小鼠的兩條下肢。將它們放入另外一個(gè)消毒托盤(pán)中，并換一套新的剪子和鑷子。手術(shù)器械事先均必須消毒。

3．骨髓細(xì)胞的制備剝離肌肉，切除兩側(cè)股股，去除周圍肌肉組織后放人35mm塑料培養(yǎng)皿中，切除兩側(cè)骨的端部，用吸有a—MEM培養(yǎng)液的注射器沖壓出骨髓于一短試管中，霜10ml吸管吹打骨髓團(tuán)塊后放置10min，將懸浮的細(xì)胞移植到另一試管中。取細(xì)胞懸液0.1ml與Turk液O．9ml混合，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)有核細(xì)胞數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)，用a—MEM將骨髓細(xì)胞濃度稀釋成5×105／ml。

4．細(xì)胞接種取骨髓細(xì)胞懸液0．5ml、條件培養(yǎng)液O．5ml及FBS lml，混合于無(wú)菌試管中：加42℃軟瓊脂培養(yǎng)液3ml，迅速混合后移至35mm塑料培養(yǎng)皿中，使整個(gè)平皿底部鋪平(注意：此操作的動(dòng)作要快，溫度不能太低，瓊脂不能在未分裝前就凝固于試管中)。靜置10min后瓊脂板可*凝固，置37℃、5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)7d。

5．顯微鏡觀察與克隆計(jì)數(shù)低倍率(40～100倍)的倒置顯微鏡或解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)，含有50個(gè)以上的細(xì)胞計(jì)數(shù)一個(gè)克隆，正常骨髓的發(fā)生率為100～200個(gè)／105個(gè)骨髓細(xì)胞。